微生物选育技术在生物冶金中的应用进展

　　然而矿物微生物技术的不足之处是微生物浸出速率较慢、生产周期长，其关键是所使用的菌种活性不高，多为天然的菌种或经人工驯化的菌种。工业上微生物选育成功的例子遍布整个微生物工业史，如发酵制药业的青霉素从20个单位提高到60000个单位，但对于自养型浸矿菌种，由于其特殊的生存环境要求和特别缓慢的生长，使得它们难以培养。因此，难以研究它们的生理生化反应和遗传基础以及作进一步的遗传改良。科研人员在提高浸矿微生物菌种活性工作方面作了许多工作，本文对生物冶金菌种及其选育研究现状作了简要的回顾与分析，这些选育方法包括菌种驯化、诱变和基因工程，并提出了今后浸矿微生物菌种选育的研究方向。

　　1浸矿微生物

　　浸矿微生物是可以直接或间接地参与金属硫化矿或氧化物的氧化和溶解过程的微生物。细菌对矿物分离的作用主要来源于：1)微生物代谢的分泌物对目标矿物的选择性吸附、中和、氧化还原等作用；2)微生物选择性地将目标矿物成分吸收进入代谢环节，然后以另外一种形态或价态将矿物成分释放于环境中；3)微生物本身对目标矿物的选择性吸附、中和等作用；4)微生物分泌物及代谢过程对目标矿物复杂的吸附、氧化还原等物化作用。

　　据报道可用于浸矿的细菌有几十种，按其生长的最佳温度可以分为3类，即中温菌、中等嗜热菌和高温菌。一些常用浸矿细菌的主要性质见表1。

　　2  浸矿微生物选育的意义与方法

　　2．1选育的意义

　　菌种选育包括选种和育种。选种即根据微生物的特性，应用各种筛选方法从自然界和生产中选择需要的菌种；育种即进一步提高已有菌种的某种性能，使其更符合需要，一般通过诱变和杂交来实现。变异菌株中通常只有少数在某些性能方面比初始菌株有所提高，育种工作中也存在选种问题，选出的新菌种有待通过育种过程提高其性能，选种与育种有紧密联系[1]。目前，微生物冶金中的硬件设施和工艺流程已经比较成熟，但浸矿微生物生长速度慢，只有大肠杆菌的万分之一，且在实际浸矿体系中，表面活性剂、重金属离子、卤素离子等含量超过一定浓度时，将抑制细菌生长，甚至造成菌体死亡[2]。因此，要想充分发挥微生物浸矿方法的优势，提高其矿物浸出效果，除了进一步改进工艺外，更重要的是要加强高效菌株的选育工作，改良菌种以获得能适用多种矿石、适应能力强、氧化活性高并能大规模应用的高效工程菌。

　　2．2选育方法

　　2．2．1  驯化育种

　　与其它生物相比，微生物对环境有很强的适应能力。微生物的生长是其与外界环境相互作用的结果，在逐渐适应环境的变化过程中基因会发生突变，在适合生长发育的新环境下成为优势种。驯化按目的不同可分为活性和抗性驯化，方法是使用目的矿物不断转代培养或增加有毒离子的转代培养。刘亚洁等报道[3]铁一硫氧化细菌经过较高浓度含氟离子培养基长时间培养驯化后，筛选到的菌株可在含氟1．48g/L的溶浸液中一昼夜即可将5g/L Fe2+完全氧化。当前大多数细菌堆浸场所用菌种为驯化菌种，如张卫民等报道了[4]永平铜矿浸矿细菌经过4次驯化后，溶液中Fe2+的转化速率明显提高，Fe的沉淀率明显减少，而pH逐渐下降。

　　浸矿细菌对金属离子的抗性主要由质粒基因编码[5]。目前质粒抗性机理研究还不够深入。而张东晨等[6]对质粒在硫杆菌中普遍存在的观点提出了质疑，研究结果表明，氧化亚铁硫杆菌对Fe2+、S等的氧化能力可能只是与拟核染色体DNA有关，而其遗传物质就是拟核染色体DNA。

　　2．2．2  诱变育种

　　诱变育种是利用物理或化学的因素(如紫外线、亚硝基胍、微波等诱变剂)处理微生物群体，促使少数个体细胞的遗传物质(主要是DNA)的分子结构发生改变，使基因内部的碱基配对发生差错，从而引起微生物的遗传性状发生突变。根据应用的要求，可以从突变株中筛选出某些具有优良性状的菌株供科研和生产使用。目前这方面的报道较多，采用的诱变手段各异，均取得较好效果。如徐晓军等报道了[7]经紫外线诱变的浸矿细菌对黄铜矿的浸出率比原始菌提高了46％以上，到达浸出终点的时间也缩短了5～10天。蒋金龙等[8]用亚硝基胍(NTG)对氧化亚铁硫杆菌进行诱变育种，发现诱变后菌株的氧化活性在原先的基础上提高了4倍。熊英等报道了[9]经驯化后的氧化亚铁硫杆菌用紫外线、微波作为诱变剂进行复合处理诱变选育 T．f菌的氧化活性由未被驯化、诱变前的0．07g/(L·h)提高到3．18g/(L·h)。

　　以特定矿物为培养基选育细菌，利用矿物自身的特性，可以最大限度地减少有效菌种的损失，选育出适合矿物浸出的优势菌种。刘新星等[10]用磁选机将磁黄铁矿按照不同磁感应强度进行分离后，作为选育菌种的磁性培养基，筛选在不同磁性培养基中生长的最适菌群。试验结果表明，强磁性培养基可以选育出以短杆状、无磁性颗粒菌为主的菌群，而弱磁性培养基可以选育出长杆状、有磁性颗粒菌为主的菌群。选育出的菌种与原始菌种相比，完全氧化培养基中亚铁的时间由88小时缩短到30～46小时，其中尤以中磁性矿物选育的菌种氧化活性高。

　　诱变育种所获得的优良菌株要应用到工业实际中去，必须是遗传稳定的突变菌株，亦即在菌种保存和应用过程中其突变或抵制基因突变的频率要很小，这就要求在育种过程中作一段长期的培养和观测，反复传代观测其性状稳定性；当培养稳定时，还要对保存的菌种作一定时期的复活培养，分离其未回复突变株、淘汰其回复突变株，并确定适当的保存方法和时期。

　　2．2．3基因工程育种

　　基因工程育种是指利用基因工程方法对生产菌株进行改造而获得高产工程菌，或是通过微生物间的转基因而获得新菌种的育种方法。来源不同的氧化亚铁硫杆菌菌株对金属硫化矿物的浸出效果是不一样的，说明氧化亚铁硫杆菌具有复杂的遗传特性。贺治国等[11]通过4个引物RAPD分析获得的平均相似性系数表明不同来源的氧化亚铁硫杆菌菌株之间的相关系数在44％～83％之间。贝雷A D、汉斯福德G S对两株氧化亚铁硫杆菌的染色体基因组大小进行了研究，发现其大小为2．9Mb左右[12]。据报道，在氧化亚铁硫杆菌的glmS基因的 C-端发现了一个代号为Tn5468的转座子，其序列与Tn7相似。在来源于不同地点的菌株染色体上存在两种20～30个拷贝的重复序列，ISTl和 IST2能在染色体DNA中移动，使菌落发生表型转移[13]。1994年Peng等[14-15]利用大肠杆菌IncP族质粒转移到氧化亚铁硫杆菌中并表达其功能的特性，使该质粒上的两个抗性基因(卡那霉素和链霉素基因)和抗砷基因(Asr)被成功地转移到氧化亚铁硫杆菌中。徐海岩等[16]利用氧化亚铁硫杆菌抗砷工程菌Tf 59(pSDX3)处理含砷金精矿，获得了较好的抗砷效果。赵清等[17]通过利用DNA体外重组技术，构建了含有强启动子、可在tra基因诱动下转移的组成型表达的抗砷质粒pSDRA4。通过接合转移的方式将其导入专性自养极端嗜酸性喜温硫杆菌AcidithiobaciIIus C 11 Idw中，构建了冶金工程菌Acidithiobac．1lus caldus(pSDRA4)，重组质粒在喜温硫杆菌中具有较好的稳定性(重组质粒保留76％以上)，与野生菌相比，构建的喜温硫杆菌工程菌抗砷能力明显提高，从10mmol/L提高到45mmol/L。

　　3  结语

　　为了提高氧化亚铁硫杆菌的适应范围和应用价值，研究工作者对其育种工作进行了大量研究，所采用的育种方式主要有驯化、诱变以及基因工程育种等。

　　结合菌种选育在生物冶金中的应用现状，今后可深入开展以下研究工作：

　　——复合诱变剂处理浸矿微生物的诱变育种；

　　——微生物选育中诱变育种的作用机理，以便更好地指导诱变操作和生产实践，更好地控制诱变条件；——综合考虑菌种的筛选和培育及其它影响因素，取不同的菌株进行正交实验，实现最优控制；——浸矿微生物的分子生物学领域基础性研究；——基因工程育种技术构建出能大规模应用于工业的高效工程菌。